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《集美大学》 2019年
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基因定点突变和适配体小肽对拟穴青蟹主要过敏原的影响

梅雪娇  
【摘要】:蟹类等甲壳类水产品作为联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一,由其引起的食物过敏反应通常伴随终身,对过敏患者的生活造成严重影响。本文针对拟穴青蟹中(Scylla paramamosain)主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM)和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)的抗原表位进行深入研究,通过基因定点突变和适配体小肽技术降低TM和AK的致敏性,得到的低致敏性蛋白可望用于水产品过敏患者的免疫治疗。本研究对TM和AK构象表位中关键氨基酸和半胱氨酸进行基因定点突变,构建重组表达载体pET-28a-mTM/mAK,在E.coli BL21(DE3)菌株中诱导表达得到TM的2种可溶性多突变体蛋白,分别命名为mTM1(TM/_(R90A-E164A-Y267A))和mTM2(TM/_(N132A-M171A-Y267A));AK的3种包涵体突变蛋白,分别命名为mAK1(AK/_(C201A))、mAK2(AK/_(K33A-T174A))和mAK3(AK/_(T174A-C201A))。采用兔抗青蟹TM/AK的IgG多克隆抗体进行Western blot鉴定,确定重组表达产物为目标蛋白。圆二色谱和表面疏水性结果显示,与重组TM(rTM)相比,mTMs均具有典型的α-螺旋结构,其二级结构没有产生明显变化,三级结构发生明显改变。与rTM相比,mTM1的IgE免疫结合活性显著降低18.1%,而mTM2的免疫结合活性没有明显改变。与重组AK(rAK)相比,mAKs的二级结构和三级结构都明显改变,尤其是mAK3的结构变化最显著,α-螺旋含量显著降低22.7%;此外,mAK1、mAK2和mAK3的IgE结合活性分别降低52.9%、41.1%和70.6%。建立树突状细胞(dendritic cells,DCs)吞噬模型和BALB/c小鼠敏化模型对突变型蛋白进行体内外实验分析,结果显示,DCs对rTM和mTMs的吞噬能力没有明显变化;在AK组实验中,DCs对mAK1和mAK3的吞噬能力显著高于rAK和mAK2。在小鼠实验中,相较于PBS组,实验组小鼠血清中特异性IgG抗体水平极显著上升,脾脏淋巴细胞中的IL-4细胞因子水平也显著上升。分析TM和AK的蛋白酶酶切位点和线性表位,采用分子对接技术筛选能够特异性结合TM和AK线性表位的适配体小肽。经兔抗青蟹IgG抗体检测,TM的12个适配体小肽对rTM和mTMs均有抑制作用,其中,适配体小肽5对rTM、mTM1和mTM2的抑制率分别达到29.7%、30.2%和31.1%。AK的IgG和IgE抑制性ELISA结果显示,5个适配体小肽对rAK和mAKs的免疫结合活性均有抑制作用,其中,适配体小肽3对rAK、mAK1、mAK2和mAK3的IgG免疫结合活性的抑制率分别是30.6%、25.8%、27.6%和23.5%,对rAK和mAKs的IgE免疫结合活性的抑制率分别是28.3%、25.2%、26.5%和21.7%。综上,通过TM和AK的分子改造,得到低致敏性的突变型蛋白和适配体小肽,有望降低甲壳类水产品主要过敏原的致敏性,并应用于水产品过敏疾病的免疫治疗。
【学位授予单位】:集美大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R392

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